古良才丨大规模制造高密度DNA芯片的「活字印刷术」登刊Ce-l

古良才丨大规模制造高密度DNA芯片的「活字印刷术」登刊Ce-l

　　古良才丨大规模制造高密度DNA芯片的「活字印刷术」登刊Ce-l

电脑芯片制造,芯片制造心得,驱蚊芯片制造　　2016 年，一篇描述用 DNA 芯片原位捕获 RNA 技术的论文：空间转录组学（Spatial Transcriptomics）于 Science 杂志发表，正式拉开了基于DNA芯片的空间组学时代的序幕。

　　电脑芯片制造,芯片制造心得,驱蚊芯片制造近年来，空间组学在学术界和工业界均引发了研究热潮，同时促进了相关产业的繁荣。例如10x Genomics、因美纳（Illumina）、华大基因（BGI）等国内外知名制造企业先后下场，试图从单细胞、高分辨率、多组学等多个维度切入市场并深入布局。然而，受限于当前 DNA 芯片制造的技术壁垒，相关研究及产业化的成本依然居高不下，有限的空间检测分辨率同样亟待提高。

　　11 月 10 日，来自华盛顿大学的古良才教授及其团队在顶尖科学期刊 Cell 在线发表了关于 DNA 芯片印刷技术与单细胞空间组学的突破性工作。该研究中，团队首次使用聚丙烯酰胺凝胶制造出均匀连续、高密度的 DNA 芯片，并将该芯片命名为 polony 凝胶。基于新材料制造的 polony 凝胶分辨率可低至 1 微米，基本实现在组织切片中划分单细胞。并且在单一芯片上能够实现至少 50 次重复印刷，显著降低了芯片的制造成本。

　　研究团队将 polony 凝胶运用于空间转录组学，发明并搭建了新的单细胞空间转录组技术平台——Pixel-seq。在该技术高空间分辨率的支持下，团队绘制了小鼠重要且相对复杂的脑干区域的单细胞水平空间基因表达图谱，并首次揭示了慢性神经性疼痛诱发的脑区内各类细胞发生的基因差异表达。

　　该项研究的通讯作者古良才对此介绍道，“当前各类单细胞空间组学技术以及相应 DNA 芯片的成本仍然很高，不利于该技术的推广。因此，我们计划在进一步优化 polony 凝胶芯片印刷技术之后，将其运用于芯片的大规模量产，从而推动其在更多领域中的广泛应用。”

　　古良才现于华盛顿大学任职生物化学助理教授。他曾先后在兰州大学、清华大学和美国密歇根大学获得了学士、硕士以及博士学位，2009-2015 年古良才在哈佛医学院George Church实验室进行博士后研究，发明了基于 polony 原位扩增与测序的超高通量单分子蛋白互作检测技术。

　　其中，空间编码（spatial barcoding）技术操作相对简易，不需要终端用户购买较为昂贵的特殊仪器与特殊设计的 RNA 探针，能直接对全转录组进行分析。所以这类技术更容易在一般实验室广泛普及。该类方法利用 DNA 芯片上的寡核苷酸阵列捕获组织 RNA，通多用 NGS 分析空间编码与基因序列将 RNA 及其空间位置关联起来。

　　目前广泛使用的 DNA 芯片由高密度的 DNA 点阵构成，点阵中的每一个点对应一簇带有特定空间编码的 DNA 分子。这类 DNA 阵列被有序固定在玻璃或其他固体片表面，生产成本十分高昂。近几年报道的分辨率到达 10 微米以下的芯片的空间编码在芯片表面是随机分布的，所以在制造过程中需要对每个阵列中的空间编码进行测序，从而限制了其生产通量与成本效益。

　　在新的研究中，古良才及其团队提供了一种可大规模扩展的 DNA 芯片制造方案：使用聚丙烯酰胺胶作为芯片基底，在这种具备弹性的凝胶上实现两个胶面之间的 DNA 聚合酶复制，同时对复制的 DNA 进行桥式扩增，并且，复制后的凝胶依然能够保持亚微米级的分辨率，在经过连续 50 次复制后并没有出现明显的 DNA 点阵点丢失，分辨率逐渐降低的情况。

　　这种方式就像是使用 DNA 阵列作为“印章”进行连续打印的“活字印刷术”。该研究团队发现，通过 DNA 聚合酶复制的方法进行连续生产并不会对“初始印章”造成严重损耗，除此之外，凝胶表面上的 DNA 桥式扩增提高了复制效率。经过复制的凝胶甚至可以在下一轮制造中充当“印章”。在此之后，只需对一个或几个复制凝胶进行测序，即可获知一系列打印的空间编码的位置地图。

　　基于 polony 凝胶打印技术，研究团队进一步展示了其自主构建的单细胞空间转录组技术 Pixel-seq，并使用该技术绘制了小鼠臂旁核（PBN）组织的单细胞水平空间基因表达图谱。

　　臂旁核（PBN）是位于脑桥内的神经核团，该区域被广泛认为是生物体内负责从脊髓向脑内传送疼痛信息的中继站，并且其向脑内杏仁核传送的信息还将引起疼痛相关的情绪反应。不过，人们对于其异质结构和具体的细胞成分知之甚少。

　　古良才表示，通过创建小鼠 PBN 的细胞图谱，研究团队确定了此前已知和新发现的神经元类型的区域特异性分布。并且，通过进一步针对 PBN 神经元和神经胶质细胞进行解剖学和转录组学比较，团队首次揭示了慢性神经性疼痛诱发的脑区内各类细胞发生的基因差异化表达。

　　研究表明，人体的组织一般是由众多形状不规则、直径 10 微米到 100 微米不等的细胞连接在一起的三维结构。

　　因此，想要在空间组学分析中实现可靠的单细胞分辨率，首先需要构建比细胞更小的 DNA 芯片点阵单元，其直径应接近甚至小于 1 微米。在此之后，在 DNA 芯片捕获转录模板分子的过程中控制住芯片表面的模板扩散也同样重要。

　　本次研究中，polony 凝胶芯片使用独创性的聚丙烯酰胺胶基底，这为实现更高的空间分辨率打下了良好基础。事实上，polony 凝胶同时满足上述两点要求：与市面的测序芯片上非连续分布的点阵不同，polony 凝胶芯片点阵由连续且均匀分布、平均直径约为 1 微米的 DNA 簇构成，该结构更适用于观测连续、完整的生物组织结构。

　　另一方面，聚丙烯酰胺胶基底可以把模板的扩散控制在小于 1 微米的范围内。“这是由于聚丙烯酰胺胶基底是亲水多孔状结构，相对于玻璃或者硅晶片类的硬质基地，多孔结构能够有效抑制模板扩散。”古良才进一步解释道，与之相比，模板分子在玻璃或者硬质固体表面扩散通常会高达几微米，严重降低现有芯片的单细胞分辨率。

　　在 Pixel-seq 平台进行的验证试验中，研究团队证实：基于 polony 凝胶材料的空间组学分析，即使没有组织固定也能够产生和细胞形状很好吻合的 cDNA 信号，从而清晰地描绘神经元细胞体的边界。

　　有趣的是，这种具有优越性能的凝胶打印方法仅需要一个简单的机械臂和现成的试剂即可完成。进一步来看，其基于凝胶表面重复印刷的特性显著降低了芯片的制造成本，并且有助于极大提升产能。与依赖于测序的同样的芯片制造相比，该方法将成本至少降低至现有生产成本的 1/35 ，时间缩短至大约 7 小时。”古良才对此介绍道，“现在，团队正在进一步提高 polony 凝胶的稳定性，为大规模生产做准备。”

　　古良才自 2015 年来到华盛顿大学后，便致力于在多个生物医学技术领域中开展研究工作。不仅包括单细胞、亚细胞空间组学技术方向，针对蛋白分子传感器（protein sensors）的设计也是他的重点研究领域。这些研究与他在求学期间丰富的科研经历不无关联。

　　古良才介绍道，他曾在硕士期间研究蛋白质的结构与功能，又在博士期间接触到了海洋天然产物的生物合成研究。“当时，我计划未来主要从事合成生物学的研究。但是，2009 年在哈佛医学院George Church实验室的博后经历彻底改变了最初的计划。”

　　在那里，古良才学习到了 polony 技术、蛋白展示技术等，并且发明了超高通量单分子蛋白互作检测技术，并获得美国技术专利。古良才回忆道，“自那时起，如何将所学到、接触到、发明的新技术有机的结合起来，开发生物医学相关的新技术，并将这些技术应用于更广泛的生物医学领域，成为了始终萦绕在我脑中的问题。而空间转录组学就是这个答案。”

　　可以说，在博后工作阶段打下的技术基础、拓展的兴趣是古良才后来成功开发 Pixel-seq 的原因和关键所在。在 Pixel-seq 研究过程中，如何有效融合多学科的知识与技术是团队面临的主要挑战。

　　举例来说：筛选 polony 凝胶的基底需要对高分子材料的结构有深入的理解，polony 的扩增则涉及较多分子生物学与酶学知识，而 polony 测序需要搭建特殊需求的测序平台，polony 凝胶的打印则需要实现对于机械手臂的精准控制等等。

　　▲图丨古良才教授及其团队，从左至右依次为：董润泽博士，孙立博士，古良才教授，付笑男博士（来源：受访者提供）

　　为此，古良才组建起了一支跨学科的研究团队。在过去七年间，古良才实验室在 polony 测序与 Pixel-seq 方向先后培养了 17 名研究员、博后和学生。团队成员的背景涉及生化、材料、机械电子、计算机、统计学、神经生物学等多个学科。

　　“在我看来，基于 DNA 芯片的空间转录组技术是有可能完全替代当前传统的单细胞测序技术。不过，完成这一替代过程需要进一步提高 DNA 芯片的捕获效率和空间分辨率，以及针对紧靠在一起、但来自不同细胞的模板分子进行更准确的划分。”古良才认为，在实现 DNA 芯片大规模制造的基础上，该技术在众多具有挑战性的研究领域中的广泛应用将被有力的推动起来。